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Cell Counting Kit-8 (CCK-8试剂盒)

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Cell Counting Kit

货号：TQ-BG-025

保存条件：2-8℃保存12个月

产品说明：

Cell Counting Kit-8，简称CCK-8试剂盒，是一种基于WST-8 而广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速、高灵敏度、无放射性的比色检测试剂盒。CCK-8 溶液可以直接加入到细胞样品中，不需要预配各种成分。WST-8 在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的甲瓒产物(formazan)(参考图1)。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅(生成的formazan 量)和细胞数目呈线性关系(图2)。

 

产品组成：

组分

规格

Cell Counting Kit

5ml/500T

操作说明：

本试剂盒可以用于细胞因子等诱导的细胞增殖检测，也可以用于抗癌药物等对细胞有毒试剂诱导的细胞毒性检测，或一些药物诱导的细胞生长抑制检测。

  1. 制作标准曲线
  1. 先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞；
  2. 按比例依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做5-7个细胞浓度梯度，每组4-6孔；
  3. 接种后培养2-4小时使细胞贴壁，然后每100μL培养基加10μL CCK-8试剂培养一定时间后测定OD值，制出一条以细胞数量为横坐标，OD值为纵坐标的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出来未知样品的细胞数量。用此标准曲线的前提条件是试验条件完全一致。
  1. 细胞活性检测
  1. 在96孔板中接种细胞悬液（100μL/孔），将培养板放在培养箱中预培养24小时；
  2. 向每孔加入10μL的CCK-8 溶液（注意不要产生气泡）；
  3. 将培养板置于培养箱内孵育1-4小时；
  4. 用酶标仪测定在450nm 处的吸光度。
  1. 细胞增殖-毒性检测
  1. 在96孔板中接种细胞悬液(100μL/孔),将培养板放在培养箱中预培养24小时；
  2. 向培养板加入不同浓度的待测药物；
  3. 将培养板在培养箱孵育一段适当的时间；
  4. 向每孔加入10μL的CCK-8 溶液（注意不要产生气泡）；
  5. 将培养板置于培养箱内孵育1-4小时；
  6. 用酶标仪测定在450nm 处的吸光度。

 

注：如果待测药物有氧化性或还原性，可在加入CCK-8 之前更换新鲜培养基，去掉待测药物的影响。当待测药物影响比较小的情况下可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入待测药物后的空白吸收即可。

注意事项：

1.CCK-8 的培养时间一般为1-4小时，但在培养30分钟左右即可取出肉眼观察显色程度。根据细胞种类而定，需要摸索条件，CCK-8 的最佳反应时间以具体显色的最佳时间为准；

2.使用96孔板进行检测时，如果细胞培养时间较长，一定要注意蒸发问题。一方面，由于96孔板周围一圈最容易蒸发，可以采取弃用周围一圈的办法，改加相同量的PBS、水或培养液；另一方面，可以把96孔板置于靠近培养箱内水源的地方，以缓解蒸发；

3.本试剂盒的检测依赖于脱氢酶催化的反应，所以还原剂（例如一些抗氧化剂）会干扰检测。如果待检测体系中存在较多的还原剂，需设法去除。用酶标仪检测前需确保每个孔内没有气泡否则会干扰测定；

4.加入药物中如含有金属，对CCK-8 显色有影响。终浓度为1mM 的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制 5%、15%、90%的显色反应，使灵敏度降低；如果终浓度是10mM 的话，将会100%抑制；

5.培养基中的酚红不会影响实验结果，酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响；

6.本产品可以检测E.coli,但不能检测酵母细胞。向100μL E.coli培养液中加10 μLCCK-8 溶液；并培养1-4小时或过夜；

7.CCK-8 试剂对细胞的毒性非常低。它和活细胞内的脱氢酶持续反应使溶液颜色不断加深，OD 值不断增加（注：活细胞内的脱氢酶是持续产生的）；

8.要测定细胞的具体数量，建议同时做标准曲线；

9.建议采用多通道移液器，以减小平行孔间的差异；

10.以下方法可以终止CCK-8 反应（96孔板）：

(a).在显色反应后，将培养板放置4℃冰箱内；

(b).每孔加10μL 0.1M HCI 溶液；

(c).每孔加10μL 1%(w/v) 的SDS （十二烷基硫酸钠）溶液。

 

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